連接法測序

❶ 基因測序的步驟是什麼

基因測序的方法很多。

最早是用sanger測序法，原理是雙脫氧鏈終止法；
Sanger法是根據核回苷酸在某答一固定的點開始，隨機在某一個特定的鹼基處終止，並且在每個鹼基後面進行熒游標記，產生以A、T、C、G結束的四組不同長度的一系列核苷酸，然後在尿素變性的PAGE膠上電泳進行檢測，從而獲得可見的DNA鹼基序列。

第二代測序法的原理是「邊合成邊測序」；
第二代測序法是以待測序列為模板，按照鹼基互補配對原則進行合成，每新加一個鹼基就進行一次掃描，讀出這個鹼基，最終獲得完整的DNA序列。

第三代測序法的原理是「單分子測序」
與第二代相比，第三代不需要合成，即拿來原始的待測DNA，直接讀出鹼基順序，第三代測序方法有多種，但依照的原則都是「單分子測序」。

❷ 平末端鏈接，測序後，順序經常是反的，怎麼避免

這個平末端鏈接，正反都能有，這個不能避免的，但是可以在測序判斷反正。PCR擴增，一端採用載體上的通用引物，另一端採用目的基因上結合的引物，PCR之後根據條帶大小就可以看出來了。

❸ 連接T載和不連T載測序結果不一樣怎麼辦

一般來說，一段基因序列經過克隆後，克隆到載體中進行測序。在兩個層次上發生變化。版首先在PCR擴增的過權程中可以產生錯誤。將片段插入到載體中也可能發生突變.其次測序准確率的問題。ABI公公司承諾其儀器的測序准確度在一定范圍內可以達到98.5%以上。由於准確率的限制，在一個較長的序列中發生鹼基序列錯誤時難以避免的，在確認克隆準確無誤的情況下，通過雙向測序可以最大限度減少測序的錯誤。您如果想得到最准確的序列，進行雙向測序時必要的。只進行單項測序，無法保證序列的完全准確性，這是由儀器的精確度決定的.
至於終止密碼子是否在測序上的看您的終止子是否在這一片段上即終止子位置.假若不再這一段序列當然不能找到.

❹ 末端終止法測序的原理和方法

末端終止法測DNA序列即SANGER雙脫氧鏈終止法,其原理是:

DNA鏈中核苷酸以3』,5』-磷酸二專酯鍵連接，合成DNA所用的屬底物是 2』-脫氧核苷三磷酸。2』,3』ddNTP與普通dNTP不同，它們在脫氧核糖的3』位置缺少一個羥基。在DNA聚合酶作用下通過三磷酸基團摻入到延伸的DNA鏈中，但由於沒有3』羥基，不能同後續的dNTP形成磷酸二酯鍵，因此，正在延伸的DNA鏈不能繼續延伸。在DNA合成反應混合物的4種普通dNTP中加入少量的一種ddNTP，鏈延伸將與偶然發生但卻十分特異的鏈終止競爭，產物是一系列的核苷酸鏈，其長度取決於引物末端到出現過早鏈終止位置間的距離。在4組獨立酶反應中分別採用4種不同的ddNTP，結果將產生4組寡核苷酸，它們將分別終止於模板鏈的A、C、G或T位置。

❺ 加減法DNA測序整個過程和化學測序的過程（最好有圖片說明）

以下都是思路，具體的反應和實驗細節，假如思路清楚後，隨便找一本實驗書就可以明白。這兩種方法，思路上很簡單，很多教科書，特別是實驗書上都有圖可參考。因為不懂，所以更要多看多翻多想。
【下面的回答，有謬誤，請大家指正和完善】
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加-減法（plus-minus sequencing）: Sanger於1975年發明，使人們有可能第一次「讀」出DNA的鹼基序列。

首先，在做「加法體系」和「減法體系」以前的工作。
待測DNA的單鏈作為模板，一個合適的引物，四種dNTP，用同位素標記。
DNA聚合酶從引物開始合成一條互補鏈，理想情況是，合成所產生各種長度的片段都存在。
然後除去那些未參與合成的dNTP，將剩下的合成產物，分成兩部分。
一部分用於加法系統，一部分用於減法系統。

加法系統：將用於加法系統的產物再分成四小份，每一小份中僅僅將四份中的dNTP的一種加入反應體系。比如僅加入dATP。由於DNA由聚合酶具有3′→5′的外切酶活性，而反應體系中缺少另外三種必要的dNTP，合成產物就從3′→5′方向降解。然而由於存在dATP，顯然遇到dA的位置降解反應就停止了。因而所有的片段都是以A結尾的。同理，可以分別制備以C、G或T結尾的另外三組片段。
四組片段在同一塊凝膠板的不同樣品槽中同時電泳（這類圖LZ可以在書上隨便找到），從放射自顯圖上就可以推斷出鹼基序列，因為從A樣品槽查出的放射性區帶代表A在片段中的位置，同理也可定出C、G和T的位置。
【加法系統實際就是以降解為條件，以DNA聚合酶的3′→5′的外切酶活性為基礎，當降解過程遇到試劑中所富含的dNTP時，反應就停止】

按理只用一個加法系統就足以推斷DNA的鹼基序列了。但由於技術上的原因，只用一種方法有時不能得到完全正確的結果，因此又設計了一種減法系統。

減法系統：也是將上述酶促產物分成四小份，每一小份中只加入三種dNTP，比如缺少dATP。在這個反應體系中，DNA聚合酶能夠把片段繼續合成下去，但是在遇到應該是dATP參入的位置時，合成反應就停下來了。這就可以得到一個都是以A前一個位置為結尾的片段組，電泳後同樣可以定出A的位置。
【減法系統實際就是以合成為條件，當合成過程缺少需要的dNTP時，反應就停止】

但此加減法並不盡如人意，由於反應速度上的差異，有些片段可能多些，另一些片段可能少些，有時可能導致漏讀和重讀，有時圖譜上還會出現假譜線，當同樣鹼基排列時圖譜上有時只出現一條帶。因此用這個方法測定DNA片段可能有1/50的誤差。目前常用的是它的改進法-雙脫氧末端終止法。

剩下的就是讀板的問題，可以想到，在理想情況下，比如以A結尾的各種長度的片段，出現的可能性是均等的。那麼在聚丙烯醯胺凝膠電泳中，相對分子量小的片段遷移速度快。書上的圖，都是一塊板子，有四個列，分別是以四種不同結尾的核苷酸的電泳情況。跑在越前面的（也就是最靠近底部的），就第一個被讀出來，隨後的相對分子量不斷增大，遷移速度慢，也就是比較大的片段，按其順序和所處的列，就克直觀讀出序列。

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【化學法（chemical method）】由Maxam-Gilbert在1977年發明。

一、取待測DNA片段，既可以是單鏈也可以是雙鏈。
此法又叫化學切割法，或化學降解法，切割之前先對待測片段作末端標記。用放射性P32-磷酸集團標記鏈的末端之一。

二、將標記完的樣品，分成四份。分別採用不同的化學試劑對所得樣品，進行修飾進而切割【切割就是利用特異的化學試劑，修飾DNA分子中不同的鹼基，使被修飾的鹼基之間的連接變得不穩定，發生斷裂，而產生各種長度的DNA片段。】
【四組切割的方法，在G、G+A、T+C、C處切割】
「+」就是同時切割，有點討厭的是這點，能修飾A，使其糖苷鍵不穩定的甲酸，同時也會使G的不穩定，所以無奈就有了G+A並在一起，
（1）G反應，"硫酸二甲酯"，使鳥嘌呤G的N7原子甲基化，而與脫氧戊糖之間的糖苷鍵不穩定，可在中性環境中受熱斷裂，得到一系列G末端的片段。
（2）G+A反應 "甲酸",使A和G嘌呤環上的N原子質子化，糖苷鍵變得不穩定，可用哌啶將其斷裂，得到一系列A和G混合的末端的片段。
（3）T+C反應 "肼"，使T和C的嘧啶環斷裂，通過消除反應，使DNA鏈發生斷裂，得到一系列T+C末端的片段。
（4）C反應 在NaCl存在時，只有C與肼反應，得到一系列C末端的片段。

用上面加減法一樣的電泳，克得到結果，直觀讀出。
至於為什麼（2）（3）兩步，為什麼是G+A、T+C？
事實上，如果有單獨只斷A的或只斷T的修飾方法，也可以。但從書上列出的圖中，可以看出，斷裂的混合物G+A、T+C電泳後並不影響讀結果。
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❻ Sanger法測序的介紹

在分子生物學研究中，DNA的序列分析是進一步研究和改造目的基因的基礎。目前用於DNA測序的技術主要有Frederick Sanger發明的Sanger雙脫氧鏈終止法（Chain Termination Method）

❼ T載上連接2000bp的目的片段，請問怎麼測序，謝謝！！

一般情況下用T載體上抄通用襲M13引物，選擇雙向測序可以達到測通的效果。但是對應的兩個末端的結果不太可靠，所以需要人為的選擇、拼接一下，當然一些測序公司會根據測序的情況自動給你拼接好。如果不放心，可以直接選擇「測通」，公司會在已經測出穩定結果的地方幫你再合成一條引物繼續往前測，直到測到載體序列為止。
2K的帶，選雙向測序，自己拼接一下就可以了。

❽ Sanger法測序的原理是什麼

Sanger法測序的原理就是利用一種DNA聚合酶來延伸結合在待定序列模板上的引物。直到摻入內一種鏈終止核苷酸為止容。每一次序列測定由一套四個單獨的反應構成，每個反應含有所有四種脫氧核苷酸三磷酸(dNTP)，並混入限量的一種不同的雙脫氧核苷三磷酸(ddNTP)。由於ddNTP缺乏延伸所需要的3-OH基因，使延長的寡聚核苷酸選擇性地在G、A、T或C處終止。終止點由反應中相應的雙脫氧而定。每一種dNTPs和ddNTPs的相對濃度可以調整，使反應得到一組長幾百至幾千鹼基的鏈終止產物。它們具有共同的起始點，但終止在不同的核苷酸上，可通過高解析度變性凝膠電泳分離大小不同的片段，凝膠處理後可用X-光膠片放射自顯影或非同位素標記進行檢測。

❾ DNA的化學法（Gilbert法）測序步驟，注意不是SANGER

(1)先將DNA的末端之一進行標記,通常為放射性同位素32P;
(2)在多組互相獨立的化學反應版中分別進行特定鹼基權的化學修飾;
(3)在修飾鹼基位置化學法斷開DNA鏈;
(4)凝膠電泳將DNA鏈按長短分開;
(5)根據放射自顯影顯示區帶,直接讀出DNA的核苷酸序列
化學降解較之鏈終止法具有明顯優點:所測序列來自原DNA分子而不是酶促合成所產生的拷貝.

❿ 鳥槍法測序和作圖法測序有什麼區別

單次測序的長度是有限制的（比如100bp，我隨便舉的數字），所以需要將DNA打散成100bp的小段再內進行測序容。作圖法測序是先將DNA分解成更大一點的長度（比如3000bp，還是隨便舉的），然後把這一段3000的序列通過mapping定位到染色體上某段位置（比如已知的兩段基因中間），再把3000的序列打散成100的序列進行測序。鳥槍法直接把基因組全部打散成100bp的序列，測序後通過程序尋找互相覆蓋的部分進行連接得到整個的序列結果。印象中應該是作圖法錯誤率低，而鳥槍法效率高