连接法测序

❶ 基因测序的步骤是什么

基因测序的方法很多。

最早是用sanger测序法，原理是双脱氧链终止法；
Sanger法是根据核回苷酸在某答一固定的点开始，随机在某一个特定的碱基处终止，并且在每个碱基后面进行荧光标记，产生以A、T、C、G结束的四组不同长度的一系列核苷酸，然后在尿素变性的PAGE胶上电泳进行检测，从而获得可见的DNA碱基序列。

第二代测序法的原理是“边合成边测序”；
第二代测序法是以待测序列为模板，按照碱基互补配对原则进行合成，每新加一个碱基就进行一次扫描，读出这个碱基，最终获得完整的DNA序列。

第三代测序法的原理是“单分子测序”
与第二代相比，第三代不需要合成，即拿来原始的待测DNA，直接读出碱基顺序，第三代测序方法有多种，但依照的原则都是“单分子测序”。

❷ 平末端链接，测序后，顺序经常是反的，怎么避免

这个平末端链接，正反都能有，这个不能避免的，但是可以在测序判断反正。PCR扩增，一端采用载体上的通用引物，另一端采用目的基因上结合的引物，PCR之后根据条带大小就可以看出来了。

❸ 连接T载和不连T载测序结果不一样怎么办

一般来说，一段基因序列经过克隆后，克隆到载体中进行测序。在两个层次上发生变化。版首先在PCR扩增的过权程中可以产生错误。将片段插入到载体中也可能发生突变.其次测序准确率的问题。ABI公公司承诺其仪器的测序准确度在一定范围内可以达到98.5%以上。由于准确率的限制，在一个较长的序列中发生碱基序列错误时难以避免的，在确认克隆准确无误的情况下，通过双向测序可以最大限度减少测序的错误。您如果想得到最准确的序列，进行双向测序时必要的。只进行单项测序，无法保证序列的完全准确性，这是由仪器的精确度决定的.
至于终止密码子是否在测序上的看您的终止子是否在这一片段上即终止子位置.假若不再这一段序列当然不能找到.

❹ 末端终止法测序的原理和方法

末端终止法测DNA序列即SANGER双脱氧链终止法,其原理是:

DNA链中核苷酸以3’,5’-磷酸二专酯键连接，合成DNA所用的属底物是 2’-脱氧核苷三磷酸。2’,3’ddNTP与普通dNTP不同，它们在脱氧核糖的3’位置缺少一个羟基。在DNA聚合酶作用下通过三磷酸基团掺入到延伸的DNA链中，但由于没有3’羟基，不能同后续的dNTP形成磷酸二酯键，因此，正在延伸的DNA链不能继续延伸。在DNA合成反应混合物的4种普通dNTP中加入少量的一种ddNTP，链延伸将与偶然发生但却十分特异的链终止竞争，产物是一系列的核苷酸链，其长度取决于引物末端到出现过早链终止位置间的距离。在4组独立酶反应中分别采用4种不同的ddNTP，结果将产生4组寡核苷酸，它们将分别终止于模板链的A、C、G或T位置。

❺ 加减法DNA测序整个过程和化学测序的过程（最好有图片说明）

以下都是思路，具体的反应和实验细节，假如思路清楚后，随便找一本实验书就可以明白。这两种方法，思路上很简单，很多教科书，特别是实验书上都有图可参考。因为不懂，所以更要多看多翻多想。
【下面的回答，有谬误，请大家指正和完善】
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加-减法（plus-minus sequencing）: Sanger于1975年发明，使人们有可能第一次“读”出DNA的碱基序列。

首先，在做“加法体系”和“减法体系”以前的工作。
待测DNA的单链作为模板，一个合适的引物，四种dNTP，用同位素标记。
DNA聚合酶从引物开始合成一条互补链，理想情况是，合成所产生各种长度的片段都存在。
然后除去那些未参与合成的dNTP，将剩下的合成产物，分成两部分。
一部分用于加法系统，一部分用于减法系统。

加法系统：将用于加法系统的产物再分成四小份，每一小份中仅仅将四份中的dNTP的一种加入反应体系。比如仅加入dATP。由于DNA由聚合酶具有3′→5′的外切酶活性，而反应体系中缺少另外三种必要的dNTP，合成产物就从3′→5′方向降解。然而由于存在dATP，显然遇到dA的位置降解反应就停止了。因而所有的片段都是以A结尾的。同理，可以分别制备以C、G或T结尾的另外三组片段。
四组片段在同一块凝胶板的不同样品槽中同时电泳（这类图LZ可以在书上随便找到），从放射自显图上就可以推断出碱基序列，因为从A样品槽查出的放射性区带代表A在片段中的位置，同理也可定出C、G和T的位置。
【加法系统实际就是以降解为条件，以DNA聚合酶的3′→5′的外切酶活性为基础，当降解过程遇到试剂中所富含的dNTP时，反应就停止】

按理只用一个加法系统就足以推断DNA的碱基序列了。但由于技术上的原因，只用一种方法有时不能得到完全正确的结果，因此又设计了一种减法系统。

减法系统：也是将上述酶促产物分成四小份，每一小份中只加入三种dNTP，比如缺少dATP。在这个反应体系中，DNA聚合酶能够把片段继续合成下去，但是在遇到应该是dATP参入的位置时，合成反应就停下来了。这就可以得到一个都是以A前一个位置为结尾的片段组，电泳后同样可以定出A的位置。
【减法系统实际就是以合成为条件，当合成过程缺少需要的dNTP时，反应就停止】

但此加减法并不尽如人意，由于反应速度上的差异，有些片段可能多些，另一些片段可能少些，有时可能导致漏读和重读，有时图谱上还会出现假谱线，当同样碱基排列时图谱上有时只出现一条带。因此用这个方法测定DNA片段可能有1/50的误差。目前常用的是它的改进法-双脱氧末端终止法。

剩下的就是读板的问题，可以想到，在理想情况下，比如以A结尾的各种长度的片段，出现的可能性是均等的。那么在聚丙烯酰胺凝胶电泳中，相对分子量小的片段迁移速度快。书上的图，都是一块板子，有四个列，分别是以四种不同结尾的核苷酸的电泳情况。跑在越前面的（也就是最靠近底部的），就第一个被读出来，随后的相对分子量不断增大，迁移速度慢，也就是比较大的片段，按其顺序和所处的列，就克直观读出序列。

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【化学法（chemical method）】由Maxam-Gilbert在1977年发明。

一、取待测DNA片段，既可以是单链也可以是双链。
此法又叫化学切割法，或化学降解法，切割之前先对待测片段作末端标记。用放射性P32-磷酸集团标记链的末端之一。

二、将标记完的样品，分成四份。分别采用不同的化学试剂对所得样品，进行修饰进而切割【切割就是利用特异的化学试剂，修饰DNA分子中不同的碱基，使被修饰的碱基之间的连接变得不稳定，发生断裂，而产生各种长度的DNA片段。】
【四组切割的方法，在G、G+A、T+C、C处切割】
“+”就是同时切割，有点讨厌的是这点，能修饰A，使其糖苷键不稳定的甲酸，同时也会使G的不稳定，所以无奈就有了G+A并在一起，
（1）G反应，"硫酸二甲酯"，使鸟嘌呤G的N7原子甲基化，而与脱氧戊糖之间的糖苷键不稳定，可在中性环境中受热断裂，得到一系列G末端的片段。
（2）G+A反应 "甲酸",使A和G嘌呤环上的N原子质子化，糖苷键变得不稳定，可用哌啶将其断裂，得到一系列A和G混合的末端的片段。
（3）T+C反应 "肼"，使T和C的嘧啶环断裂，通过消除反应，使DNA链发生断裂，得到一系列T+C末端的片段。
（4）C反应 在NaCl存在时，只有C与肼反应，得到一系列C末端的片段。

用上面加减法一样的电泳，克得到结果，直观读出。
至于为什么（2）（3）两步，为什么是G+A、T+C？
事实上，如果有单独只断A的或只断T的修饰方法，也可以。但从书上列出的图中，可以看出，断裂的混合物G+A、T+C电泳后并不影响读结果。
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❻ Sanger法测序的介绍

在分子生物学研究中，DNA的序列分析是进一步研究和改造目的基因的基础。目前用于DNA测序的技术主要有Frederick Sanger发明的Sanger双脱氧链终止法（Chain Termination Method）

❼ T载上连接2000bp的目的片段，请问怎么测序，谢谢！！

一般情况下用T载体上抄通用袭M13引物，选择双向测序可以达到测通的效果。但是对应的两个末端的结果不太可靠，所以需要人为的选择、拼接一下，当然一些测序公司会根据测序的情况自动给你拼接好。如果不放心，可以直接选择“测通”，公司会在已经测出稳定结果的地方帮你再合成一条引物继续往前测，直到测到载体序列为止。
2K的带，选双向测序，自己拼接一下就可以了。

❽ Sanger法测序的原理是什么

Sanger法测序的原理就是利用一种DNA聚合酶来延伸结合在待定序列模板上的引物。直到掺入内一种链终止核苷酸为止容。每一次序列测定由一套四个单独的反应构成，每个反应含有所有四种脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)，并混入限量的一种不同的双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)。由于ddNTP缺乏延伸所需要的3-OH基因，使延长的寡聚核苷酸选择性地在G、A、T或C处终止。终止点由反应中相应的双脱氧而定。每一种dNTPs和ddNTPs的相对浓度可以调整，使反应得到一组长几百至几千碱基的链终止产物。它们具有共同的起始点，但终止在不同的核苷酸上，可通过高分辨率变性凝胶电泳分离大小不同的片段，凝胶处理后可用X-光胶片放射自显影或非同位素标记进行检测。

❾ DNA的化学法（Gilbert法）测序步骤，注意不是SANGER

(1)先将DNA的末端之一进行标记,通常为放射性同位素32P;
(2)在多组互相独立的化学反应版中分别进行特定碱基权的化学修饰;
(3)在修饰碱基位置化学法断开DNA链;
(4)凝胶电泳将DNA链按长短分开;
(5)根据放射自显影显示区带,直接读出DNA的核苷酸序列
化学降解较之链终止法具有明显优点:所测序列来自原DNA分子而不是酶促合成所产生的拷贝.

❿ 鸟枪法测序和作图法测序有什么区别

单次测序的长度是有限制的（比如100bp，我随便举的数字），所以需要将DNA打散成100bp的小段再内进行测序容。作图法测序是先将DNA分解成更大一点的长度（比如3000bp，还是随便举的），然后把这一段3000的序列通过mapping定位到染色体上某段位置（比如已知的两段基因中间），再把3000的序列打散成100的序列进行测序。鸟枪法直接把基因组全部打散成100bp的序列，测序后通过程序寻找互相覆盖的部分进行连接得到整个的序列结果。印象中应该是作图法错误率低，而鸟枪法效率高